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Western blotting實驗步驟
1.蛋白質(zhì)的樣品制備:
取心肌組織50mg,待組織塊自行溶解,用濾紙吸去其表面水分,將組織塊放入玻璃勻漿器球狀部位,用組織剪盡量將其剪碎,將剪碎的心肌組織放入玻璃勻漿器的桿狀部,按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌組織的比例加入RIPA和PMSF(先加RIPA再加PMSF),將玻璃勻漿器插入冰中,勻漿約30分鐘。
將心肌組織勻漿轉(zhuǎn)移到離心管中,4℃12000g離心5分鐘,收集上清(如有粘稠物進一步用超聲處理),樣品分裝凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/span>
2 .測定蛋白濃度:
2.1 按50:1配置BCA工作液。
2.2 10ulC液(蛋白標準)+90ulPBS液稀釋成0.5mg/ml的蛋白標準液。
2.3 分別以0、1、2、4、8、12、16、20ul將蛋白標準液加入96孔板的第1~8標準孔中,在其他樣品孔中加入10ul待測樣品。
2.4 分別加PBS定容至20ul。
2.5 各孔中加入200ulBCA工作液,室溫放置2小時。
2.6 用酶標儀測定蛋白濃度:測定A562,依標準曲線算出蛋白濃度。
3 SDS-PAGE電泳:
3.1 制 膠: 按比例配制分離膠,緩緩地搖動溶液,使激活劑混合均勻,將凝膠溶液平緩地注入兩層玻璃極中,再在液面上小心注入一層水,以阻止氧氣進入凝膠溶液中,靜置40min。同前按比例配制濃縮膠,但混勻溶液時不要過于劇烈以免引入過多地氧氣。吸去不連續(xù)系統(tǒng)中下層分離膠上的水分,連續(xù)平穩(wěn)的注入凝膠溶液,然后小心插入梳子并注意不得在齒尖留有氣泡,靜制60min以上以保證*聚合。
3.2 預電泳: 將聚合好的凝膠安置于電泳槽中,小心拔去梳子,加入電泳緩沖液后低電壓10-20V的預電泳20-30min。(目的是清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì), 疏通凝膠孔徑以保證電泳過程中電泳的暢通)。
3.3 樣品準備:首先計算上樣體積,然后按樣品:上樣buffer=4:1的比例加入上樣bufer混勻,沸水煮10分鐘,冰上5分鐘。
3.4 加 樣: 預電泳后依次加入標準品(Marker)和待分析樣品。(加樣時間要盡量短,以免樣品擴散,可在未加樣的孔中加入等量的樣品緩沖液避免邊緣效應。每個泳道加5ul。
3.5 電 泳: 加樣完畢,選擇80V恒壓進行電泳,電泳直至溴酚藍染料前沿到達兩膠交界處(一般約20分鐘),更換至100V恒壓電泳,電泳直至溴酚藍染料前沿下至凝膠末端處,即停止電泳(一般約為1小時20分鐘)。
4.轉(zhuǎn) 膜:
4.1 切膠:將電泳完畢的膠完整的放在盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中,將目的蛋白所在區(qū)域切下來,測量其長寬,并記錄。
4.2 剪膜和濾紙:按膠的尺寸剪膜和濾紙(濾紙長寬較凝膠小0.5~1mm,PVDF膜長寬較凝膠大0.5~1mm),濾紙浸入盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中10秒鐘,膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒鐘,然后將兩者都放入盛有去離子水的玻璃皿中3分鐘,進一步放入盛有電轉(zhuǎn)液的玻璃皿中3分鐘。
4.3 向電轉(zhuǎn)槽中倒入部分電轉(zhuǎn)液,將海綿浸入。按如下順序制作“三明治”(注意避免兩邊濾紙相互接觸,以免發(fā)生短路)。從正極到負極按如下順序排列:正極-海綿-雙層濾紙-PVDF膜-凝膠-雙層濾紙-海綿-負極。(其中不能留有氣泡)卡緊轉(zhuǎn)膜板,電轉(zhuǎn)槽中倒?jié)M電轉(zhuǎn)液,將轉(zhuǎn)膜板浸入電轉(zhuǎn)槽中,注意正負極要正確。插上電源,設定恒流20mA轉(zhuǎn)膜,4℃冰箱中。
5、膜的封閉: 用TBST液洗滌印跡膜10分鐘x2次。放入5%脫脂奶粉封閉液內(nèi),搖床震動,70轉(zhuǎn)/分鐘,室溫封閉1小時30分鐘。
6、一抗孵育:
6.1 配制一抗:按相應抗體的效價加入一抗稀釋液,一抗稀釋液按0.05% TBST(ml):脫脂奶粉(g)=20:1配制。
6.2一抗孵育:將封閉后的膜放入雜交袋中,加入一抗約1ml,室溫搖床(70轉(zhuǎn)/分鐘)孵育1小時30分鐘。
6.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。
7、二抗孵育:
7.1 配制二抗:按相應抗體的效價加入二抗稀釋液,二抗稀釋液按0.05%TBST(ml):脫脂奶粉(g)=20:1配制。
7.2 二抗孵育:將一抗孵育后的膜放入二抗中,室溫搖床(70轉(zhuǎn)/分鐘)孵育1小時30分鐘。
7.3 用TBST洗滌膜10分鐘x3次。
8、ECL顯色
8.1 配制ECL工作液:在避光的容器中按A液:B液=1:1的比例配制。
8.2 按膜:工作液=10cm2:1ml的比例將ECL工作液覆蓋到膜表面,放置1~2分鐘后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。
我們的實驗過程如下:
電泳: SDS-PAGE; 預電泳 恒壓55 V 20 min,上樣25 ul, 恒壓55 V 40 min左右,當樣品至分離膠面時,恒壓75 V,到考馬斯亮藍至底部,停止電泳。
轉(zhuǎn)?。褐谱鬓D(zhuǎn)印三明治,150 mA。8%-90 min,10%-80min,12%-50min。中止轉(zhuǎn)印,有條件可以利用麗春紅檢測總蛋白轉(zhuǎn)印是否成功。
封閉:將轉(zhuǎn)印膜取出,用去離子水清洗,TBST洗一次5 Min后,加入5%的脫脂牛奶封閉,于28度封閉2小時。(注意封閉液,一抗稀釋液,二抗稀釋液均含有脫脂牛奶,可以配成含0.01%硫柳汞的溶液以免牛奶變質(zhì))
洗膜1次,10 min,
一抗孵育:一抗?jié)舛?:100(2.5%牛奶抗體稀釋液),4度孵育隔天
洗膜4次,每次15 min
二抗孵育:二抗?jié)舛?:3000(2.5%牛奶抗體稀釋液),28度孵育1.5-2 H
洗膜4次,每次15 min(建議洗膜完畢后,不要立刻顯色,靜置或者輕搖1.5h-2h后再顯色)
顯色:注意顯色時間的控制和曝光時間的控制
祝您工作順利,實驗順利!